“4-3. 分离部分”中指出，分析物被流动相携带一起通过色谱柱时与色谱柱中的填料发生相互作用，从而被分离，但样品成分之间在色谱柱中是如何被分离的呢？
让我们把样品成分比作“人”，把色谱柱比作“商店街”，来思考一下分离原理。
喜欢购物的A、事先计划好要买什么的B、勤俭节约的C同时进入商店街。A在各种各样的商店停留，一边在橱窗购物一边走出商店街。B只买了事先决定好的东西，然后离开商店街。C在商店街走过，没有在任何商店停留。三人同时进入商店街，但走出商店街的顺序却是C、B、A。这是因为三个人的购物偏好程度不同。（图6）

 

让我们回到HPLC的话题。
HPLC用填料上有各种“小机关”，样品中的各成分在通过色谱柱时和这些“小机关”相互作用。不同成分之间的相互作用程度不同，从而导致在色谱柱中通过的时间（在色谱柱中停留的时间）不同，进而使各种成分得到分离。
然而，上述三个人走出购物街的顺序是否总是一样呢？在购物时突然下雨，没带伞的B匆匆忙忙冲出去，可能比撑了伞的C更早走出商店街。他们出来的顺序可能会随着情况的改变而改变。
在HPLC中，"情况发生变化"被"分析条件发生变化"所取代。这里的分析条件是指流动相的成分、流速、色谱柱温度等。
即使使用相同的填料（色谱柱），根据分析条件的不同，各组分也可能有时可以分离，有时无法相互分离。特别是流动相的组成，对样品成分和填料的相互作用影响很大。此外，如果改变分析条件也无法改善分离效果，则有必要考虑采用不同 "小机关 "的色谱柱。这就是HPLC的难点所在。
改变分析条件可以使无法分离的成分相互分离，反之，也可能使分离的成分无法分离。
基于多年来积累的丰富知识和经验，Shodex采集了大量应用数据，这些数据可在Shodex网站上查阅。您可以按应用领域、样品名称或产品名称或关键词进行搜索。请使用本网站进行色谱柱选择及分析条件的探讨。

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如图7(a)所示，当样品成分与流动相一起进入色谱柱时，它们呈带状扩散。然后，每种样品成分与填料反复作用并通过色谱柱，相互作用越弱，移动速度越快，越早从色谱柱中洗脱出来。
检测器不断输出电信号，数据处理器将接收到的电信号记录为信号强度随时间的变化。 这就是色谱图。 如图7(b)所示，当检测器检测到样品成分时，信号强度增加，色谱图上出现山形波（峰）。

 

理想的峰型是对称的高斯曲线，但也可能出现前倾（前延）现象，即峰的前半部分比后半部分上升得更平缓；或者相反，出现拖尾现象，即峰的后半部分拖尾。此外，如果被分析物质在色谱柱中的扩散量较大（即带宽较宽），峰的总体宽度也会变宽。（图8）

 

这些峰型可能会导致洗脱时间接近的各种分析成分以及和杂质间的分离效果不佳，并由于峰高变低而灵敏度下降。具有良好效率（性能）的色谱柱，分析物在色谱柱内的扩散很小，可以获得对称的尖锐峰形。在实际操作中，除了色谱柱之外，设备、分析条件和样品载量也会对峰形有很大影响，因此创造一个能够充分发挥色谱柱性能的环境也非常重要。

以下对 “色谱图的各部分名称”、“色谱柱性能相关参数”、“色谱柱分离相关参数” 这些HPLC相关的基本术语进行分别说明。

从色谱图中可以读取各种信息，而不仅仅是色谱峰的位置和大小。色谱图的名称如图9所示。

色谱柱无法保留成分的峰的最高点（峰顶）出现为止的体积（时间），被称为 “死体积”和“死时间”。

峰宽是峰的两侧拐点处的切线与连接峰两端的直线（基线）交点处的宽度。而半峰宽是峰高的中点处的峰宽。

以下是理论塔板数以及体现对称性的非对称系数与对称系数的介绍。

理论级数是峰值尖锐度的指标，数值越高，表明色谱柱性能越好。理论塔板数的计算方法有很多种，图10显示了两种具有代表性的方法，即半宽法和正切法。《日本药典》（JP）和《美国药典》（USP）都使用半宽法，Shodex 也使用半宽法进行计算。请注意，理论塔板数会随着样品和分析条件的不同而变化。

理论塔板高度是一个理论塔板对应的色谱柱长度（单位：mm），数值越小表示色谱柱性能越高。理论塔板数与色谱柱长度成正比，但理论塔板高度与色谱柱长度无关，因此理论塔板高度被作为填料的性能指标。

不对称系数和对称系数都是峰对称性的指标，其定义分别如图11所示，Shodex使用不对称系数。在这两个指数中，Fas (S)= 1表示峰对称，Fas (S) > 1.0 表示峰拖尾，Fas (S) < 1.0 表示峰前延。

色谱柱产品的出厂检测报告包含了理论塔板数和不对称系数以及色谱柱压力等数值。如果要检查手边色谱柱的情况，和出厂检测报告对比是非常简单的方法。但是，理论塔板数和不对称系数的数值会因取样条件和分析条件的不同而有很大差异，因此，如果要将色谱柱的性能与出厂时的性能进行比较，请确保使用和出厂检测报告中描述相同的样品及分析条件。

与峰分离相关的参数包括保留系数、分离系数以及分离度。

保留系数是衡量分析物保留强度的指标。它是分析物的保留时间减去死时间再除以死时间后的值，表示各分析物在固定相中的停留时间与在流动相中的停留时间之比。

分离系数是衡量相近色谱峰之间选择性差异的指标。其计算方法是用后面峰的保留系数 (k₂)除以前面峰的保留系数 (k₁)。通常，分离系数总是大于1。

分离度是衡量两个相邻峰分离程度的指标。使用公式 (1) 根据每个峰的洗脱时间和半峰宽计算，分离度超过1.5意味着峰完全分离（基线分离）。当两个峰宽相等时，分离度可以用公式 (2) 表示。

由此可见，分离度与理论塔板数（色谱柱性能）、分离系数（选择性）、保留系数（保留能力）有关。如图12所示，如果其中任何一个参数极差，基线分离就会变得困难。为了实现相邻峰的分离，必须在均衡地提高每个参数，这就是为何选择色谱柱与优化分析条件（特别是流动相）非常重要的原因。

色谱柱由柱管和填料组成。在此分别进行说明。

如上所述，HPLC涉及到高压设备。此外，HPLC还使用各种有机溶剂以及酸性和碱性溶剂作为流动相，需要满足耐压、耐水和耐溶剂性要求，因此不锈钢 (SUS)通常被用作色谱柱管材使用，另一方面，虽然聚醚醚酮 (PEEK)在耐压性和耐溶剂性方面不如不锈钢，但是分析需要避免与金属接触的样品时，常使用PEEK作为色谱柱管材。

填料基本上由作为骨架的"基质"和与基质结合的"键合相"组成，但也有一些填料只使用基质而不结合任何键合相。
填料基质大致分为硅胶基质和聚合物基质。

 

自HPLC问世之初，硅胶基质广泛作为填料使用。硅胶基质填料包括单独的硅胶以及键合各种官能团的硅胶。硅胶基质色谱柱的特点，已经被广泛熟知为ODS色谱柱，其实是硅胶基质上键合碳元素个数为18的十八烷基 (Octadecyl: C₁₈)的色谱柱总称。硅胶基质通常具有出色的分离性能和较高的机械强度，但受 pH 值的限制，在酸性条件下稳定性较低，在碱性条件下容易溶解。

聚合物基质有多种类型，其中最常见的是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯和聚乙烯醇。聚合物基质的特征，与硅胶基质一样，既有单独的聚合物基质作为填料，也有聚合物基质键合官能团作为填料。聚合物基质能在很宽的pH值范围内使用，具有化学稳定性高的特点。Shodex利用其在聚合物合成技术方面的专业知识，开发了许多聚合物基质的HPLC用色谱柱。

用于HPLC的填料大多是上述硅胶和聚合物基质，但也有使用如纤维素、琼脂糖、糊精和壳聚糖等天然物质
及羟基磷灰和氧化皓（一种陶瓷）作为基质的产品。

以前，HPLC只使用细颗粒作为填料，但近年来也开始使用整体柱 (monolith)作为填料。下面就介绍一下细颗粒和整体柱的区别。

作为HPLC填料使用的细颗粒，颗粒直径从几微米到几十微米不等，如图 13(a) 所示，表面通常有大量小孔。小孔的大小（孔径）取决于填料，基本上在几纳米到几十纳米不等。流动相和分析物不仅仅和颗粒表面接触，也会进入小孔中，所以含有小孔可以增加和填料的接触面积。另一方面，小孔也和填料的强度及分析物的扩散有关，在某些应用中也可以使用没有小孔的颗粒。有小孔的被称为多孔型，没有小孔的被称为无孔型颗粒。

整体柱是指被模压成棒状的连续的骨架结构。如图 13(b) 所示，整体柱是一个整体载体，流动相通过整体柱内部，在其空隙表面发生相互作用。与颗粒柱相比，整体柱具有孔隙率更高，压力更低，可以进行高流速的送液等特点。本讲座主要以颗粒填料作为基础进行介绍。

相互作用一词已多次出现，在高效液相色谱中，使用相互作用的分离方法被称为 "分离模式"。键合相是决定分离模式的关键，根据分离模式不同，使用的键合相也不同。另外，一种分离模式不一定只有一种键合相，有时也会存在多种键合相。通过改变键合相来改变分离模式的情况也并不少见。想想键合相与基质的组合方式，HPLC的填料实际上也是多种多样。

进行分析的色谱柱被称为分析柱，有些产品也配备了保护柱或保护过滤器。
样品中并不是只有分析物的存在。杂质的存在会影响分析结果。此外，不溶解的杂质可能导致色谱柱堵塞，而可溶的杂质可能进入色谱柱内部导致色谱柱劣化。因此，含有杂质的样品在分析前一般要经过如液-液萃取、固相萃取等各种前处理，或者过滤去除不溶解的杂质，但即使进行了前处理也不一定能完全去除杂质。
保护柱对吸附在色谱柱上的杂质特别有效。保护柱是填充了和分析柱相同填料的比分析柱尺寸小的色谱柱，连接在分析柱的上游（进样器与分析柱之间）。由于样品先经过保护柱，吸附性杂质会被保护柱吸附而避免进入分析柱。在整个保护柱被污染前请清洗或更换保护柱以防止或减少分析柱被污染的可能性。另一方面，保护过滤器可以有效过滤样品中的不溶性杂质。使用保护过滤器可能捕获不溶性杂质避免其进入分析柱。
保护柱和保护过滤器的价格一般低于分析柱，因此使用好保护柱或保护过滤器可以延长色谱柱的使用寿命从而带来经济效益。