ポリマー系アミノカラムHILICpak VG-50 2Dとトリプル四重極質量型(QQQ)のLC-MS/MSを組み合わせたイノシトールポリリン酸の分離例を紹介します。イノシトール7リン酸(IP7)はイノシトール6リン酸(フィチン酸; IP6)を前駆体とし、細胞内リン酸化酵素によって生合成されます。ヒト結腸腺癌細胞株HCT116をピロリン酸分解酵素阻害剤であるフッ化ナトリウム(NaF)で処理することで細胞内IP7の蓄積が認められます。このようにVG-50 2DとLC-MS/MSを組み合わせることで高度リン酸化分子の高感度分析を可能にします。さらに本例では、分子内リン酸基によるLC配管内の金属イオンとの吸着を防ぐためにメチレンジホスホン酸を添加した溶離液を用いることでIP6、IP7共に10 pmol程度の検出が可能となりました。
前処理方法
- (1)細胞をPBSで2回洗浄した後、Lysis buffer (0.01 %Triton X-100, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl)にて細胞を溶解する。
- (2)細胞溶解液に2 M 過塩素酸水溶液で除タンパク処理し、得られた上清に酸化チタンビーズ添加し、イノシトールポリリン酸を吸着させる。
- (3)4 ℃で30分間インキュベートした後、2 M 過塩素酸水溶液で酸化チタンビーズを2回洗浄する。
- (4)10 % アンモニア水溶液加え、酸化チタンビーズに結合したイノシトールポリリン酸を溶出させる。
- (5)(4)のステップを繰り返した後、全量を集めて乾固し、100 mM Ammonium carbonate aq./CH3CN=60/40で再溶解し、試料溶液とする。
Sample: 50 μL
- Column
- ：Shodex HILICpak VG-50 2D (2.0 mm I.D. x 150 mm)
- Eluent
- ：(A); 300 mM Ammonium bicarbonate buffer (pH10.5) + 5 µM Methylenediphosphonic acid
(B); (100 mM Ammonium bicarbonate buffer (pH10.5) + 5 µM Methylenediphosphonic acid)/CH3CN=10/90
Gradient; 75 % (B) 0 -2 min, 75 % (B) - 2 % (B) 2 - 12 min, 2 % (B) 12 - 15 min, 75 % (B) 0 -2 min 15 - 35 min - Flow rate
- ：0.4 mL/min
- Detector
- ：LC-MS/MS (triple quadrupole mass spectrometer)
- Column temp.
- ：45 ℃
聖マリアンナ医科大学法医学教室 伊藤 誠敏先生ご提供
参考文献
- (1)Ito M, Fujii N, Wittwer C, Sasaki A, Tanaka M, Bittner T, Jessen HJ, Saiardi A, Takizawa S, Nagata E. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. J Chromatogr A. 2018 Oct 26;1573:87-97. doi: 10.1016/j.chroma.2018.08.061.
- (2)Ito M, Fujii N, Kohara S, Hori S, Tanaka M, Wittwer C, Kikuchi K, Iijima T, Kakimoto Y, Hirabayashi K, Kurotaki D, Jessen HJ, Saiardi A, Nagata E. Inositol pyrophosphate profiling reveals regulatory roles of IP6K2-dependent enhanced IP7 metabolism in the enteric nervous system. J Biol Chem. 2023 Mar;299(3):102928. doi: 10.1016/j.jbc.2023.102928.