介绍了聚合物基质氨基柱HILICpak VG-50 2D与三重四极杆质谱仪（QQQ）（LC-MS/MS)组合用于肌醇多磷酸分析的应用实例。七磷酸肌醇（IP₇）是以六磷酸肌醇（植酸；IP₆）为前体，通过细胞内磷酸化酶合成。通过用氟化钠（NaF）这一焦磷酸分解酶抑制剂处理人结肠腺癌细胞株HCT116，可以观察到细胞内IP7的积累。使用VG-50 2D与LC-MS/MS相结合，可以实现对高度磷酸化分子的高灵敏度分析。此外，在本应用实例中，为了防止分子内磷酸基团与LC管道内的金属离子吸附，使用添加了亚甲基二磷酸的流动相，从而使得IP6和IP7均可实现约10 pmol的检测限。

前处理方法

1. (1)用PBS洗涤细胞两次后，使用裂解缓冲液（0.01% Triton X-100，1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl）溶解细胞。
2. (2)在细胞溶解液中用2 M 高氯酸水溶液进行去蛋白处理，然后向得到的上清液中添加氧化钛珠，以吸附多磷酸肌醇。
3. (3)在4℃下孵育30分钟后，用2 M 高氯酸水溶液洗涤氧化钛珠两次。
4. (4)加入10%氨水溶液，洗脱与氧化钛珠结合的多磷酸肌醇。
5. (5)在第(4)步后，收集全部液体并干燥，使用100 mM 碳酸铵水溶液/CH₃CN=60/40重新溶解，得到样品溶液。

Sample: 50 μL

1.  

Column

：Shodex HILICpak VG-50 2D (2.0 mm I.D. x 150 mm)

Eluent

：(A); 300 mM Ammonium bicarbonate buffer (pH10.5) + 5 µM Methylenediphosphonic acid
(B); (100 mM Ammonium bicarbonate buffer (pH10.5) + 5 µM Methylenediphosphonic acid)/CH₃CN=10/90
Gradient; 75 % (B) 0 -2 min, 75 % (B) - 2 % (B) 2 - 12 min, 2 % (B) 12 - 15 min, 75 % (B) 0 -2 min 15 - 35 min

Flow rate

：0.4 mL/min

Detector

：LC-MS/MS (triple quadrupole mass spectrometer)
 

Column temp.

：45 ℃

圣玛丽安娜医科大学法医学教室 伊藤诚敏老师 提供

参考文献

1. (1)Ito M, Fujii N, Wittwer C, Sasaki A, Tanaka M, Bittner T, Jessen HJ, Saiardi A, Takizawa S, Nagata E. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. J Chromatogr A. 2018 Oct 26;1573:87-97. doi: 10.1016/j.chroma.2018.08.061.
2. (2)Ito M, Fujii N, Kohara S, Hori S, Tanaka M, Wittwer C, Kikuchi K, Iijima T, Kakimoto Y, Hirabayashi K, Kurotaki D, Jessen HJ, Saiardi A, Nagata E. Inositol pyrophosphate profiling reveals regulatory roles of IP6K2-dependent enhanced IP7 metabolism in the enteric nervous system. J Biol Chem. 2023 Mar;299(3):102928. doi: 10.1016/j.jbc.2023.102928.