SEC/MALSによる低分子ヘパリンの絶対分子量測定

血液凝固阻止剤として良く知られている「ヘパリン」は動物組織から分離される直鎖の多糖類です。　ヘパリンは単分散の物質ではなく、分子量範囲(Mr : Ranging in molecular weight)が5,000から30,000で平均分子量12,000-15,000の多分散混合物です。低分子量(LMW)ヘパリンは未分別のヘパリンを化学処理あるいは酵素処埋により分解し、約1/3の大きさにしたものです。 　低分子量ヘパリンはヨーロッパと日本では広く受け入れられてますが、アメリカでは低分子量ヘパリン製品が未分別のヘパリンと別の新規医薬品と見なされ、多分散性の部分について食品医薬品局(FDA)から厳しい精査を受けました。　低分子量ヘパリンのMr分布の適当な分析法が無かったために承認申請の過程で混乱した訳です。　各メーカーではSECを用いて製品のMrを求めていましたが、ヘパリンから調製されたMrスタンダードを使って校正曲線を作成し相対的な分子量を求めていたために、精度はスタンダードの品質に依存してしまいました。　各スタンダードの分子量は固有粘度や超遠心、低角度光散乱(LALLS)などを用いて求められましたが多くの費用と労力をかけた割にはあまり良い結果が得られませんでした。　そのため各社では、ヘパリンのMr分布を正確に測定する様々な方法が模索されて来ました。
我々はヘパリンMrスタンダードを用いた相対法ではなく、サイズ排除(SEC)分離と多角度光散乱検出器(MALS)を用いて絶対分子量分布測定をする方法を開発しました。　測定データはSEC/MALS法が他のバイオポリマーのMr分析に汎用に用いられるかもしれないということを暗示しています。

結果
低分子量ヘパリンのSEC/MALS分析結果
ProductDay Mp mean
(CV %)		Mw mean
(CV %)		 Mn mean
(CV %)		Mw/Mn mean
(CV %)
Fluxum1 4003(0.59)5173(0.73) 4346(1.08)1.190(0.37)
2 3795(0.19)5078(0.43) 4155(0.56)1.222(0.16)
3 3865(0.46)5107(0.24) 4100(0.06)1.246(0.27)
Overalln=9 3888(2.39)5119(0.93) 4200(2.74)1.219(1.99)
Fragmin1 4793(0.25)6115(0.75) 5531(0.57)1.190(0.37)
2 4544(0.83)6044(0.47) 5386(0.55)1.122(0.24)
3 4645(0.13)6155(0.34) 5499(0.51)1.119(0.19)
Overalln=9 4660(2.37)6150(0.93) 5472(1.29)1.116(0.71)
Fraxiparin1 3300(0.62)4340(0.41) 3714(0.93)1.169(0.55)
2 3107(0.97)4291(0.62) 3590(0.82)1.195(0.27)
3 3167(0.92)4337(1.08) 3565(1.72)1.217(0.81)
Overalln=9 3191(2.78)4323(0.86) 3623(2.18)1.194(1.82)
Logiparin1 4596(0.23)6256(0.30) 5000(0.52)1.251(0.24)
2 4368(0.81)6243(0.52) 4973(0.78)1.256(0.57)
3 4488(0.39)6183(0.74) 4702(0.89)1.315(0.32)
Overalln=9 4484(2.25)6227(0.72) 4892(2.98)1.274(2.44)

Sample : (LMW) Heparin 
Column　 : Shodex OHpak SB-803 HQ (8.0mmID*300mm)
Eluent　 : 0.1M Ammonium acetate buffer(pH7.0) + 0.05% Sodium azide
Detector : MALS(Multi angle laser light scattering), RI
※ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 245. (1997) 231-241.より抄訳